Dysfunkcyjne oddziaływanie C / EBP i receptora glukokortykoidów w komórkach mięśni gładkich oskrzeli ad 5

Swoistość obserwowanych kompleksów DNA-białko charakteryzowała się wstępną inkubacją ekstraktów z 10-krotną normalną ilością konkurencyjnego, nieznakowanego elementu reagującego na glukokortykoidy lub oligonukleotydami CCAAT.25,26,28. Koimmunoprecypitacja receptora glukokortykoidowego lub C / EBP-.
Koimmunoprecypitacje przeprowadzono w sposób opisany uprzednio.25 Ekstrakty białka jądrowego (20 .l) inkubowano przez noc w 4 ° C z przeciwciałem przeciw C / EBP. (1 .g na mililitr) lub przeciw receptorowi glukokortykoidowemu (1 .g na mililitr, Santa Cruz), a następnie inkubowano przez godzinę z białkiem A Sepharose (1 mg na mililitr) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem w 37 ° C. Po odwirowaniu przy 5000 xg przez pięć minut, osad przemyto dwukrotnie 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, a następnie ponownie zawieszono w buforze Laemmli i analizowano za pomocą immunoblottingu.
Test immunoenzymatyczny związany z enzymem interleukiny-6
Pożywkę do hodowli komórkowej zebrano 0, 6, 12 i 24 godziny po stymulacji komórek 5% surowicą płodową cielęcą w obecności lub nieobecności leków lub antysensownych oligonukleotydów. Uwalnianie interleukiny-6 wykryto za pomocą testu immunoenzymatycznego (Quantikine, R & D Systems).
Analiza statystyczna
Analizę wariancji i niesparowany test t-Studenta wykorzystano do oceny danych dotyczących liczby komórek i inkorporacji [3H] tymidyny. Wyniki uznano za znaczące, jeśli dwustronna wartość P była mniejsza niż 0,05.
Wyniki
Charakterystykę kliniczną wszystkich 54 badanych osobników, od których uzyskano komórki do hodowli komórek mięśni gładkich oskrzeli, przedstawiono w Tabeli 1. Było 35 mężczyzn i 19 kobiet. Ze względu na szeroki zakres epok wśród osób z astmą średni wiek tej grupy nie różnił się istotnie od pozostałych dwóch grup (tab. 1).
Figura 1. Figura 1. Immunoblotting, analiza densytometryczna i testy przesunięć ruchliwości elektroforetycznej w komórkach mięśni gładkich oskrzeli u osobników z astmą i osób bez astmy. Panel A przedstawia reprezentatywny immunoblot rozkładu receptora glukokortykoidowego (GR) w cytozolu i jądrze komórek mięśni gładkich oskrzeli od osobnika z astmą i osobnika z rozedmą płuc w obecności 10-8 M budezonidu. . i . oznaczają izoformy . i . GR. Panel B pokazuje analizę densytometryczną lokalizacji jądrowej GR w czasie w obecności 10-8 M budezonidu w komórkach mięśni gładkich oskrzeli z 10 kontroli, 8 osobników z rozedmą płuc i 12 osób z astmą. Słupki oznaczają średnią . SE. Panele C i D pokazują przebieg czasowy indukowanego budesonidem wiązania GR z elementem reagującym na glukokortykoidy (GRE) w reprezentatywnym teście przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej komórek mięśni gładkich oskrzeli od jednego osobnika z astmą i jednego bez astmy, odpowiednio. .
Figura 1A przedstawia reprezentatywny przebieg czasowy indukowanej budesonidem (10-8 M) translokacji receptora glukokortykoidowego z cytozolu do jądra w liniach komórek mięśni gładkich oskrzeli od osobników z astmą i osób z rozedmą płuc. Budezonid aktywował receptor glikokortykosteroidowy w ciągu 30 minut, osiągając poziom szczytowy po godzinie i następnie zmniejszając stężenie
[przypisy: anakinra, Enterolalemtuzumab, polyporus ]
[podobne: remifemin opinie, otłuszczona watroba, stoperan elektrolity ]