Dysfunkcyjne oddziaływanie C / EBP i receptora glukokortykoidów w komórkach mięśni gładkich oskrzeli ad 9

Jednak, aby zwizualizować te mniejsze prążki białek, musieliśmy podwoić czas ekspozycji immunoblotów. Aby określić, czy brak C / EBP. jest cechą patofizjologiczną obecną w komórkach innych niż komórki mięśni gładkich oskrzeli, wyizolowaliśmy limfocyty krwi obwodowej od czterech osób z astmą i czterech bez astmy. Wykryliśmy białko C / EBP. we wszystkich próbkach (Figura 4B).
Aby przezwyciężyć brak C / EBP. w komórkach mięśni gładkich oskrzeli od osobników z astmą, przejściowo transfekowaliśmy trzy takie linie komórkowe za pomocą wektora ekspresyjnego dla ludzkiego C / EBP. wyizolowanego z komórek mięśni gładkich oskrzeli od osobników bez astmy. Immunoblotting ujawnił zależny od czasu wzrost ekspresji C / EBP. w ciągu 24 i 48 godzin po transfekcji (Figura 4C). Komórki mięśni gładkich wyrażały dwa białka, które reagowały z przeciwciałem przeciwko C / EBP. (Figura 4C). Zgodnie ze znacznikami masy cząsteczkowej górny prążek pojawił się w oczekiwanej wielkości dla C / EBP., podczas gdy mniejszy prążek był podobny do drugiego pasma C / EBP., który obserwowano w nietransfekowanych komórkach mięśni gładkich oskrzeli od osobników z astmą (fig. 4A i fig. 4C). Szybkość transfekcji kontrolowano za pomocą wektora sterowanego przez promotor cytomegalowirusa naskórkowego czynnika wzrostu; poziom ekspresji naskórkowego czynnika wzrostu przez komórki mięśni gładkich oskrzeli wynosił 62 procent 24 godziny po transfekcji (Figura 4D).
Nieobecność C / EBP. w komórkach mięśni gładkich oskrzeli u osobników z astmą potwierdzono za pomocą testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej supershift z fragmentem promotora p21 (Waf1 / Cip1) zawierającym miejsce wiązania kompleksu receptora glukokortykoidu-C / EBP.23 -25,27,29 jako cel dla białek C / EBP., w obecności i pod nieobecność przeciwciał specyficznych względem C / EBP. lub receptora glukokortykoidowego; przeciwciała przeciw białku c-Fos / AP-1 służyły jako kontrola negatywna. Jak pokazano na Figurze 4E, inkubacja fragmentu promotora p21 (Waf1 / Cip1) z ekstraktami białka jądrowego, które otrzymano z komórek mięśni gładkich oskrzeli od osobników bez astmy w obecności 10-8 M budezonidu przez trzy godziny, dała określony sygnał, który można było znieść przez inkubację z 10 razy większą niż normalna ilość zimnego oligonukleotydu CCAAT przez noc w 4 ° C. Gdy kompleks utworzony przez fragment promotora p21 (Waf1 / Cip1) i ekstrakty białka jądrowego z komórek oskrzelowo-mięśniowych traktowanych budezonem dalej inkubowano z przeciwciałami swoistymi dla C / EBP., poziom kompleksu zwiększał się i jego migracja była dalsze opóźnienie (rysunek 4E, linia 4). Podobną supershift obserwowano, gdy fragment promotora p21 (Waf1 / Cip1) tworzył kompleks z ekstraktem białka jądrowego z komórek mięśni gładkich oskrzeli traktowanych budezonem od osobników bez astmy i był inkubowany z przeciwciałami specyficznymi dla receptora glukokortykoidowego (Figura 4E). , ścieżka 6), podczas gdy nie wykryto takiej supershift gdy stosowaliśmy przeciwciała przeciwko c-Fos / AP-1 (linia 8). Przeciwnie, frakcja jądro-białko otrzymana z komórek mięśni gładkich oskrzelowych traktowanych budezonidem od osobników z astmą nie dawała wyraźnego sygnału, gdy były inkubowane z fragmentem promotora p21 (Waf1 / Cip1) (Figura 4E, ścieżki 5, 7 i 9).
Rysunek 5
[patrz też: hurtownia portfeli, Enterolalemtuzumab, klimakterium ]
[patrz też: oksydaza ksantynowa, xyzal opinie, psycholog dziecięcy piła ]