Dysfunkcyjne oddziaływanie C / EBP i receptora glukokortykoidów w komórkach mięśni gładkich oskrzeli czesc 4

Transfekcję prowadzono przy użyciu .g DNA na mililitr i Tfx50 (stosunek 1: 2 do 1: 4) przez jedną godzinę w pożywce bez surowicy. Pięć procent surowicy płodowej cielęcej dodano następnie do pożywki na 24 godziny przed wykonaniem mikroskopii konfokalnej żywych komórek (model LSM 510, Zeiss). Długość fali wzbudzenia laserowego wynosiła 488 nm; fluorescencję wykrywano pomiędzy 505 i 550 nm przy użyciu otworu otworkowego o wielkości 106 .m. Autofluorescencja nie została wykryta między 560 a 615 nm przy użyciu długości fali 543 nm. Wyciągi jądrowe i cytosolowe oraz test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej
Wyciągi jądrowe i cytosolowe przygotowano z hodowli, które były w 80% konfluentne, jak opisano poprzednio.25 Komórki mięśni gładkich oskrzeli zeskrobano z kolb 175 cm i wirowano przy 5000 x g przez 2 minuty w 4 ° C, i osad ponownie zawieszono. w 80 .l buforu o niskiej zawartości soli (20 mM HEPES [pH 7,9], 10 mM chlorku potasu, 0,1 mM wanadanu sodu, mM EDTA, mM EGTA, 0,2 procent NP-40, 10 procent glicerolu i pełnego inhibitora proteazy [ Roche Diagnostics]) i inkubowano przez 10 minut w 4 ° C. Po odwirowaniu przy 13000 xg przez jedną minutę w temperaturze 4 ° C zebrano supernatant (frakcja cytosolowa). Pozostały osad rozpuszczono w 50 ul buforu o wysokiej zawartości soli (420 mM chlorek sodu, 20 mM HEPES przy pH 7,9, 10 mM chlorek potasu, 0,1 mM wanadanu sodu, mM EDTA, mM EGTA, 20 procent glicerolu i kompletny inhibitor proteazy), trzymano na lodzie przez 30 minut i wirowano przy 13 000 x g przez 5 minut w 4 ° C. Zebrany supernatant uznano za frakcję jądrową.25,26,28 Poziom białka oznaczono za pomocą testu Bradforda.
Immunoblot
Białka frakcjonowano według wielkości, jak następuje: 5 .g całkowitego białka naniesiono na żel poliakryloamidowo-dodecylosiarczanowy z gradientem 4 do 15 procent i przeniesiono na membrany z polichlorku winylu (Millipore) zgodnie ze standardowymi protokołami; przeniesienie zostało potwierdzone przez barwienie Ponceau.17,25 Błony zablokowano przez dodanie 5% odtłuszczonego mleka w 10 mM TRIS, 150 mM chlorku sodu i 0,05% Tween 20 przez godzinę; inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4 ° C z pierwotnym przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla receptora glukokortykoidowego (sc-100X), C / EBP. (sc-61X) lub c-Fos / białka aktywatora-1 (AP-1) (sc-1). 253X) (wszystkie biotechnologia Santa Cruz); przemyto trzy razy w roztworze blokującym; a następnie inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem skierowanym przeciwko krążeniu przeciwbakteryjnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (sc-2054, Santa Cruz Biotechnology) przez godzinę. Membrany przepłukano trzykrotnie buforem blokującym i raz solanką buforowaną fosforanem, a prążki białkowe wizualizowano za pomocą chemiluminescencji (ECL, Pierce).
Białka wiążące DNA scharakteryzowano za pomocą testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej z użyciem wyznakowanego 32P elementu reagującego na glukokortykoidy lub oligonukleotydu wiążącego CCAAT (odpowiednio sc-2545 i sc2525, Santa Cruz Biotechnology), jak opisano wcześniej. .25 Użyliśmy również fragmentu promotora p21 (Waf1 / Cip1) znakowanego 32P zawierającego miejsca wiążące C / EBP (dar od Dr B. Vogelstein, Johns Hopkins University, Baltimore), 29, który był używany przez innych do scharakteryzować sekwencję konsensusową DNA receptora glukokortykoidu-C / EBP. promotora p21 (Waf1 / Cip1), 23, 24, 27 i którą wcześniej stosowaliśmy do wykazania tworzenia kompleksu receptor glukokortykoidowy C / EBP.. 25 testów Supershift ( zdefiniowane przez przesunięcie ruchliwości fragmentu promotora p21) przeprowadzono przez inkubację ekstraktów jądrowych z jednym z powyższych przeciwciał (1 mg na mililitr) specyficznym dla receptora glukokortykoidowego, C / EBP. lub czynnika transkrypcyjnego AP-1 przez noc przy 4 ° DO; Kompleksy DNA-białko i supershift były analizowane na nie uwalniającym 4% żelu poliakrylamidowym wystawionym na działanie promieni X
[patrz też: celiprolol, hurtownia portfeli, dienogest ]
[więcej w: teczowa kraina, oksyhemoglobina, solanka zabłocka ]