Prolimery granulokocytów-makrofagów jako kandydaci na komórki białaczkowe w chorobie Blast-Crisis CML ad

Wszystkie badane osoby wyraziły świadomą zgodę na piśmie, a badanie przeprowadzono zgodnie z przepisami instytucjonalnych komisji recenzujących Uniwersytetu Stanforda i Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles41. Komórki zostały uzyskane od pacjentów przed rozpoczęciem leczenia imatynibem, od pacjentów, którzy mieli otrzymywał imatinib przez 6 do 15 miesięcy (22 z CML w fazie przewlekłej, 11 z CML w fazie akceleracji i 2 z CML w czasie przełomu blastycznego) oraz od pacjentów z CML opornym na imatynib (5 z CML w fazie akceleracji i z CML w kryzysie wybuchu). Pacjenci z CML w fazie przewlekłej otrzymywali interferon alfa, podczas gdy pacjenci z zaawansowaną chorobą byli często leczeni czynnikami cytoredukcyjnymi przed otrzymaniem imatinibu (opisane w Tabeli Dodatkowego Dodatku, dostępnej z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org). Izolacja hematopoetycznych komórek macierzystych i mieloidalnych genotypów
Hematopoetyczne komórki macierzyste (komórki CD34 + CD38CD90 + [Thy1 +] Lin) i mieloidalne komórki progenitorowe, w tym wspólne progenitory szpikowe (CD34 + CD38 + receptor interleukiny . + CD45RA), progenitory granulocytów i makrofagów (CD34 + CD38 + receptor interleukiny-3 . + CD45RA + ) i prekursory erytroidów megakariocytów (CD34 + CD38 + receptor interleukiny .-CD45RA) izolowano z komórek jednojądrzastych normalnych i CML za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS), jak opisano poprzednio.
Próbki komórek tworzących kolonie
Testy komórek tworzących kolonie przeprowadzono w sposób opisany uprzednio.41 W eksperymentach polegających na replikacji poszczególne kolonie otrzymano w dniu 14, przeniesiono na 96-studzienkowe płytki i analizowano 14 dni później. W niektórych eksperymentach konstrukty lentiwirusowe zawierające reporter białek LEF / TCF (GFP), kasetę kinazy fosfoglicerydowej promotor-.-katenina-wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES) -GFP kasetę lub aksyninę-fosfoglicerynian IRES-GFP kaseta została dodana do testów komórek tworzących kolonie (opisanych szczegółowo w Metodzie Dodatku Dodatkowego) .27
Test dla BCR-ABL
RNA wyizolowano z 40 do 300 hematopoetycznych komórek macierzystych, wspólnych progenitorów szpikowych, progenitorów granulocytów i makrofagów lub progenitorów erytroidalnych megakariocytów z pięciu osób kontrolnych, czterech pacjentów z CML w fazie przewlekłej, siedmiu z CML w fazie akceleracji, trzech z CML w dmuchawce kryzys, cztery po terapii imatynibem i pięć z CML opornym na imatynib. Dokonano ilościowej analizy odwrotnej transkryptazy-reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) ekspresji BCR-ABL, .-kateniny, LEF-1 i HPRT (opisane w Metodzie 2 Dodatku Aneks) .48,49
Analiza FACS .-kateniny
Komórki jednojądrzaste normalne lub CML barwiono przeciwciałem skoniugowanym z fikoerytryną przeciwko ludzkiemu CD90 lub receptorowi . interleukiny-3, oprócz sprzężonego allofikocyjaniny przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD34 i biotynylowanemu przeciwciału przeciwko ludzkiemu CD38, a następnie barwieniu sprzężonym z aleksem 594 przeciwciałem przeciwko ludzkiemu streptawidyna. Komórki następnie utrwalono 0,8% paraformaldehydem i uzyskano przepuszczalność przez wystawienie na działanie 0,3% saponiny. Komórki zabarwiono przez noc przeciwciałem skoniugowanym z izotiocyjanianem fluoresceiny przeciwko .-kateninie (Transduction Laboratories) lub kontrolnym przeciwciałem skoniugowanym z izotiocyjanianem fluoresceiny przeciwko izotypowi IgG1, płukane i analizowane za pomocą FACS.
Mikroskopia fluorescencyjna konfokalna
Hematopoetyczne komórki macierzyste lub progenitory granulocytów i makrofagów z sześciu kontroli i dziewięciu pacjentów z CML sortowano na szkiełkach za pomocą FACS, barwiono przeciwciałem skoniugowanym z izotiocyjanianem fluorosceiny przeciwko ludzkiemu CD45, utrwalano w 4% paraformaldehydzie i barwiono mysim monoklonalnym przeciwciało przeciwko aktywowanej .-kateninie (klon 8E4, Upstate Biotechnology) w rozcieńczeniu 1: 200 (2,5 .g na mililitr), jak opisano poprzednio. Następnie, skrawki wybarwiono kozim antymiastym przeciwciałem skoniugowanym z alexa 594 i plamą jądrową ( Hoechst 33342, Molecular Probes)
[patrz też: dekstrometorfan, Mimośród, chloramfenikol ]
[podobne: remifemin opinie, otłuszczona watroba, stoperan elektrolity ]