Utrata Smad3 w ostrej białaczce limfoblastycznej z limfocytów T ad

Próbki komórek białaczkowych zastosowane w badaniu zebrano w latach 1980-1990. Diagnozę dzieciństwa ALL lub ANLL wykonano za pomocą oceny morfologicznej i barwienia immunohistochemicznego szpiku kostnego. Podtyp immunologiczny komórek ustalono następnie metodą cytometrii przepływowej z użyciem przeciwciał monoklonalnych. Dorośli z zespołem Sézary ego zostali włączeni do badań klinicznych w Oddziale Medycyny Narodowego Instytutu Raka, 4 i próbki komórek białaczki zostały dostarczone przez dr Susan Bates. Dorośli z białaczką limfocytową T związaną z HTLV-1 zostali włączeni do badań klinicznych w Oddziale Metabolizmu Narodowego Instytutu Raka, a próbki komórek białaczki zostały dostarczone przez doktora Thomasa Waldmanna. Western Blotting
Komórkowe lizaty białkowe przygotowano z krioprezerwowanych próbek od dzieci z białaczką i z komórek krwi obwodowej dwóch zdrowych osobników kontrolnych. W przypadku prawidłowych limfocytów frakcje bogate w limfocyty zostały zebrane od zdrowych dawców przez leukaferezę i przeciwbieżną elirę odśrodkową zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dla ludzi. Limfocyty T oczyszczono z bogatych w limfocyty frakcji elutriacyjnych za pomocą kolumn do izolacji komórek T (zestaw do izolacji komórek T Miltenyi Pan) i hodowano lub natychmiast przetwarzano w celu ekstrakcji białka. Komórki odwirowano i przemyto dwukrotnie zimną solanką buforowaną fosforanem i poddano lizie w buforze do oznaczania radioimmunoprecypitacji (RIPA) zawierającym inhibitory proteazy, ortowanadan sodu i fluorek sodu. Lizaty sklarowano przez odwirowanie, a poziomy białka określono za pomocą oznaczenia białka kwasu bicynchoninowego (Pierce). Następnie 50 .g całkowitego białka komórkowego rozdzielono na 8% żelach TRIS-glicyny (siarczan dodecylu sodu) i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe. Membrany zablokowano w soli fizjologicznej buforowanej TRIS przy użyciu 5% mleka i 2% albuminy surowicy bydlęcej. Błony inkubowano przez noc z .g króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciw Smad3 (51-1500, Zymed Laboratories) lub mysiego monoklonalnego przeciwciała przeciw Smad2 (BD Transdukcyjne Laboratoria Transdukcyjne), przemywano trzykrotnie, inkubowano przez jedną godzinę w odpowiedniej peroksyda- skoniugowane przeciwciało drugorzędowe (Amersham Biosciences) i opracowane przy użyciu zestawu chemiluminescencyjnego wzmocnionego Super Signal (Pierce).
Oznaczanie p27Kip1 wolnego i związanego z cykliną D3
W skrócie, w celu oznaczenia wolnego pKK1 związanego z cykliną D3, komórki białaczki i oczyszczone limfocyty T krwi obwodowej poddano lizie w buforze RIPA zawierającym inhibitory proteazy (tabletki koktajlu Complete Mini protease, Roche) plus 0,1 mM ortowanadanu sodu i mM fluorek sodu. Następnie 50 .g białka w 500 .l buforu do lizy poddano immunoprecypitacji przez noc z łagodnym kołysaniem w temperaturze 4 ° C za pomocą 25 .l przeciwciała sprzężonego z agarozą przeciwko przeciwciału cyklin D3 (sc-6283AC, Santa Cruz Biotech). Supernatanty zawierające niezwiązane białka poddano immunoprecypitacji 50 .l przeciwciała sprzężonego z agarozą przeciw p27Kip1 (sc-1641AC, Santa Cruz Biotech) w 4 ° C przez sześć godzin. Ta ostatnia frakcja reprezentowała wolny p27Kip1, który nie był związany z cykliną D3
[podobne: suprasorb, dekstrometorfan, flexagen ]
[patrz też: vicebrol cena, przedszkole zielona dolina piła, androvit cena ]