Utrata Smad3 w ostrej białaczce limfoblastycznej z limfocytów T czesc 4

Komórki stymulowano przez 60 godzin związanym z płytką anty-CD3. (2 .g na mililitr) pod nieobecność lub w obecności rekombinowanego ludzkiego TGF-.1 (5 ng na mililitr), pulsowano .C trytowanej tymidyny na studzienkę przez 12 godzin, i zbierane za pomocą kombajnu do zbierania komórek Brandel. Ilość włączonej [3H] tymidyny zmierzono za pomocą spektrofotometrii scyntylacyjnej (1450 licznika scyntylacyjnego płynu Microbeta, Perkin Elmer). W równoległych seriach eksperymentów obejmujących te same warunki, supernatanty z hodowli komórkowej usunięto po 48 godzinach i zmierzono poziomy interleukiny-2 przy użyciu zestawu do testu immunoenzymatycznego Quantikine M zgodnie z instrukcjami producenta (R & D Systems) . Immunohistochemia
Białka Smad barwiono na 5-mikrometrowych odcinkach utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie mysich tkanek (serce, nerki i węzły chłonne), jak opisano wcześniej, z zastosowaniem automatycznego systemu barwienia komórek Optimax Plus 2.0 z oprogramowaniem badawczym (BioGenex). .5 Skrawki inkubowano przez dwie godziny z pierwszymi przeciwciałami wymienionymi powyżej w stężeniu 4 .g IgG na mililitr w soli fizjologicznej buforowanej TRIS z 1% albuminy surowicy bydlęcej. Jako kontrolę negatywną zastosowano króliczą lub kozią IgG (4 .g na mililitr). Kompleksy antygen-przeciwciało wykrywano przy użyciu zestawu peroksydazy kompleksu avidyna-biotyna Vectastain Elite (Vector Laboratories) zgodnie z instrukcjami producenta. Jako barwnik kontrastowy użyto hematoksyliny Carazzi.
Wyniki
Utrata Smad3 w T-Cell ALL
Rysunek 1. Rysunek 1. Poziomy Smad3 w komórkach T i komórkach pre-B-ALL. Kriokonserwowane próbki białaczki zostały przetworzone. W Tablicy A, całkowite ekstrakty komórkowe rozdzielono przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem-poliakrylamidem i przeniesiono do analizy Western blot albo Smad3 albo Smad2. Smad3 jest obecny w próbkach pobranych przed komórkami B, ale jest nieobecny lub znacznie zmniejszony w próbkach ALL komórek T. Panel B pokazuje ekspresję Smad3 i .-aktyny przez drugi zestaw WSZYSTKICH próbek, ANLL (białaczka mieloidalna), prawidłowe limfocyty krwi obwodowej (PBL) i prawidłowe komórki T. Smad3 jest obecny w lizatach PBL, limfocyty T oczyszczone z PBL, komórki pre-B ALL i ANLL, ale nie komórki T ALL. Badacz poruszający żele był nieświadomy immunofenotypu komórek. Panel C pokazuje poziom ekspresji mRNA Smad3 i .-aktyny przez próbki ALL z limfocytów T od ośmiorga dzieci, kontrolne komórki T i jedną próbkę ostrej białaczki szpikowej (AML). Panel D pokazuje poziom ekspresji Smad3 i .-aktyny przez próbki od trzech dorosłych z zespołem Sézary ego i czterech dorosłych z białaczką limfocytową T związaną z HTLV-1 (ATL).
Badaliśmy zawartość Smad3 za pomocą Western blotting w komórkach białaczkowych otrzymanych od dzieci w chwili rozpoznania. Białko Smad3 łatwo wykryto w dwóch z dwóch próbek ANLL i w sześciu z siedmiu próbek komórek ALL przed komórkami B, z niskimi poziomami wykrytymi w pozostałej próbce ALL komórek pre-B (Figura 1). Smad3 był również obecny w świeżo wyizolowanych limfocytach krwi obwodowej i oczyszczonych komórkach T od osób kontrolnych (Figura 1B), ale nieobecny lub ledwo wykrywalny we wszystkich 10 próbkach od pacjentów z ALL komórek T (Figura 1A i Figura 1B)
[patrz też: disulfiram, ceftriakson, anakinra ]
[przypisy: tęgoryjec objawy, fibrynoliza, olejek pichtowy zastosowanie ]