Wzorce ekspresji genów w opornych na leki komórkach ostrej białaczki limfoblastycznej i odpowiedź na leczenie ad

Niniejsze badanie zostało podjęte w celu zidentyfikowania genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w pierwotnych komórkach ALL wykazujących oporność lub wrażliwość na prednizolon, winkrystynę, asparaginazę lub daunorubicynę oraz w celu ustalenia, czy ekspresja takich genów wpływa na odpowiedź na leczenie. Metody
Pacjenci
Populacja badana składała się z 271 dzieci ze świeżo zdiagnozowanymi ALL: 173 zostało zapisanych jako część 9. protokołu ALL Childhood Oncology Group w Erasmus Medical Center, Sophia Children s Hospital w Rotterdamie lub protokołów leczenia 92 i 97 z German Cooperative Study Group Ostra białaczka limfoblastyczna u dzieci w Hamburgu, a 98 zostało włączonych jako część protokołów Total Therapy XIIIA i XIIIB St. Jude Children s Research Hospital w Memphis, Tennessee. 26, 27. Pacjenci zostali włączeni do niemieckiego protokołu od 1992 do 2003 roku, w Protokół holenderski od 1997 do 2004, oraz w protokołach St. Jude w latach 1991-1998. Pierwotna populacja profilująca geny składała się z 173 dzieci w protokołach holenderskich i niemieckich, a populacja z niezależną weryfikacją składała się z 98 pacjentów w Protokoły St. Jude. Rodzice lub opiekunowie pacjentów wyrazili pisemną świadomą zgodę, a pacjenci wyrazili zgodę.
Izolacja komórek białaczki
Szpik kostny i krew obwodowa uzyskano przed traktowaniem, a komórki jednojądrzaste wyizolowano za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy (gęstość, 1,077 g na mililitr; Lymphoprep, Nycomed Pharma) w ciągu 24 godzin. Komórki ponownie zawieszono w pożywce RPMI 1640 (GIBCO BRL) uzupełnionej 20% surowicą płodową (Integro), 2 mM L-glutaminą, 200 ug gentamycyny na mililitr (GIBCO BRL), 100 jm penicyliny na mililitr, 100 ug streptomycyny na mililitr, 0,125 .g fungizonu na mililitr (GIBCO BRL), 5 .g insuliny na mililitr, 5 .g transferyny na mililitr i 5 ng selenianu sodu na mililitr (suplement diety ITS, Sigma-Aldrich Chemie). Jeśli to konieczne, WSZYSTKIE próbki zostały dodatkowo wzbogacone, aby uzyskać ponad 90% blastów poprzez usunięcie niezłośliwych komórek przy użyciu perełek immunomagnetycznych (DynaBeads).
Test na lekooporność
Wrażliwość komórek białaczki na prednizolon (Bufa Pharmaceutical Products), winkrystynę (TEVA Pharma), asparaginazę (Paronal, Christiaens) i daunorubicynę (Cerubidine, Rhône-Poulenc Rorer) określono za pomocą czterodniowego in vitro 3 Test oporności na lek (4,5-dimetylotiazol-2-ilo) -2,5-difenylotetrazoliowy (MTT). Testowano następujące stężenia każdego leku: od 0,008 do 250 .g prednizolonu na mililitr, od 0,05 do 50 .g winkrystyny na mililitr, 0,003 do 10 jm asparaginazy na mililitr i 0,002 do 2,0 ug daunorubicyny na mililitr. Stężenie leku śmiertelne dla 50 procent komórek białaczki (wartość LC50) zastosowano jako miarę oporności na lek. Wartości LC50 stosowane do definiowania komórek jako czułych lub opornych na każdy czynnik to te, które wcześniej wiązały się z dobrym lub złym wynikiem leczenia u pacjentów z ALL (patrz Tabela w Dodatku Aneks, dostępna z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm .org) .3-5
Oczyszczanie, znakowanie i hybrydyzacja RNA
Całkowity komórkowy RNA wyekstrahowano z minimum 5 × 106 komórek białaczki przy użyciu odczynnika Trizol (GIBCO BRL), RNA dodatkowo oczyszczono za pomocą fenolu-chloroform-alkoholu izoamylowego (25: 24: 1), a integralność RNA oceniono jak poprzednio. opisano. 23. Przetwarzanie RNA i hybrydyzację z mikromacierzą oligonukleotydową U133A GeneChip (Affymetrix) przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta.
Analiza statystyczna
Wartości ekspresji genów obliczono za pomocą urządzenia Affymetrix Microarray Suite w wersji 5.0.23,24. Sygnały ekspresji skalowano do docelowej intensywności 2500 i przekształcono logarytmicznie
[przypisy: klimakterium, suprasorb, dronedaron ]
[hasła pokrewne: vicebrol cena, przedszkole zielona dolina piła, androvit cena ]